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2024年7月山东大学丁兆军教授团队在Advanced Science（IF=14.3）杂志上发表题为“VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis”文章。研究采用磷酸化修饰组学、LC-MS/MS质谱分析、CO-IP、酵母双杂和荧光素酶互补成像等技术，发现VIK介导的生长素信号转导分别通过增强LBD18的蛋白质稳定性和诱导ERF13的降解来调节侧根发育。拜谱生物为该研究提供了磷过酸呈现组学、LC-MS/MS磷过酸位点定量分析技术服务。
用英语名称：VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis（Advanced Science，IF=14.3，2024.07）
简体中文问题：VIK介导的生长素信号调节拟南芥侧根发育
的客户机关单位：山东大学
研究探讨物料：拟南芥侧根
拜谱带来技木：磷碱化装饰组学、LC-MS/MS磷碱化位点了解
科研设想：
PART 01 研究探讨结杲
01、植物生长素推动VIK的磷硝化作用和转录
为了鉴定生长素触发的潜在磷酸化调控因子，作者对10日龄拟南芥幼苗根用10 µM 萘乙酸（NAA）处理15分钟和8小时后进行磷硝化作用血清质酚类化合物析，结果发现VIK可能通过磷酸化修饰在介导生长素信号传递中发挥关键作用（图1A）。
图1 生長素有利于促进VIK的磷酸性反应下列不属于转录
为了验证上述结果，作者在大肠杆菌中表达了带有6个组氨酸标签的重组VIK蛋白（His-VIK），并在细胞自由蛋白系统中进行了磷过酸实验英文。发现His-VIK随着时间的推移磷酸化水平略有增加。在野生型拟南芥幼苗的根组织裂解液中，NAA处理15分钟和30分钟后，His-VIK的磷酸化水平显著增加，表明生长素能显著促进VIK的磷酸化（图1B）。
通过发酵粉双有性杂交浅析（Y2H）和烟草叶片中的荧光素酶同质显像实验室（LCI）证实了VIK与TMK1之间存在直接相互作用，并且休外磷酸性反应实验表明TMK1可以磷酸化VIK。通过生成ProVIK:VIK-GFP转基因系进行的蛋白降解实验显示生长素可能不影响VIK蛋白的稳定性（图1C）。公交实时按量PCR分析发现，生长素处理能时间依赖性地诱导VIK转录水平的增加（图1D），且这种诱导主要通过ARF7/19依赖性方式实现，在arf7/19突变体中VIK表达的诱导明显减弱，而在lbd16/18/33突变体中VIK表达仍能被生长素显著诱导。
02、VIK 介导的叶绿素卫星信号及时调整 LR 生长
依据定性分析5个VIK T-DNA加入染色体变异体（vik-2和vik-3），表示与天然的型相对来说，染色体变异体的LR体积、LR原基（LRP）和已健康期的LR为显著避免，尤其是是vik-2（图2）。相对，过体现VIK的转染色体茎秆体现出LR体积提升。再者，在vik-2染色体变异体原型下体现VIK的转染色体茎秆还原了LR健康期疵点。植物种子发芽素操作检测表示，vik-2染色体变异体对植物种子发芽素诱发的LR健康期反响下降，表示VIK在植物种子发芽素调节管控LR健康期中引领关键的影响。 
图2 VIK介导的生長素讯号径路单向调节LR的生长发育
03、VIK 与ERF13 通过初中物理交流互动行为
研究发现VIK在生长素诱导的侧根（LR）发育中扮演关键角色，因此推测ERF13可能是VIK的潜在底物。通过Y2H、LCI、双原子核荧光专一性 （BiFC）和免疫性共沉淀物中测试（CO-IP），证实了VIK与ERF13之间存在直接的相互作用（图3）。这些结果表明VIK与ERF13在物理上相互作用，支持了ERF13可能是VIK作用底物的假设。
图3 VIK与ERF13主动用
04、VIK以双面馈的手段调整ERF13磷碱化
通过磷硝化作用血清组学数据分析，发现NAA处理可快速诱导ERF13磷酸化。体外实验表明，VIK具有自磷酸化活性，并可直接磷酸化ERF13的Ser168和Ser172位点（图4）。点突变率看见显著降低了ERF13的磷酸化水平。此外，ERF13可增强VIK的自磷酸化，尤其是ERF13的磷酸模拟突变体。进一步实验表明，VIK可通过形成同源二聚体进行自磷酸化，但ERF13突变体不影响VIK二聚体的形成。总体而言，VIK通过反馈机制调控ERF13的磷酸化。
图4 VIK以双面馈方式英文磷过酸ERF13的Ser168和Ser172位点
05、VIK介导的磷酸性反应有利于促进ERF13生物降解
研究发现，VIK介导的磷酸化作用影响ERF13蛋白的稳定性，进而调控侧根发育。实验显示，ERF13蛋白在早期侧根原基中表达，随后在发育过程中消失，而VIK蛋白在所有侧根中持续表达（图5）。通过离体检测和身体里检测，发现VIK能够促进ERF13的降解。进一步通过磷酸仿真模拟和磷酸灭活变异体的实验，证实了ERF13在Ser168和Ser172位点的磷酸化促进了其降解。此外，VIK与MPK14可能协同作用促进ERF13降解，但两者之间没有直接的相互作用。最后亚肿瘤细胞定位手机探讨表明，ERF132D和ERF132A均位于细胞核，且与WT无明显差异。qRT-PCR结果显示，vik-2突变体中ERF13 mRNA水平未显著变化，但其下游基因KCS8和KCS16显著降低，进一步证明VIK在蛋白水平上调控ERF13。总之，VIK介导的磷酸化通过负调控ERF13的稳定性，加速生长素诱导的ERF13降解。
图5 VIK 介导的磷酸性反应会加快了ERF13降解塑料
06、VIK 介导的 ERF13 磷碱化缓解 LR 的冒出
一起探讨进一歩一起探讨了VIK国家宏观调控的ERF13可分解在侧根（LR）成长中的功效。进行相当各个转遗传基因花草系的LR表型，看到过理解ERF13控制了LR的显现，在vik变化体中在在这种控制功效增強，而在过理解YFP-VIK的图片背景下在在这种控制功效减退（图6）。不但，相当ERF13的各个磷酸性反应养成和磷酸解离基因变异体的过理解花草系，看到ERF132A-Myc（磷酸解离）的花草系LR显现更少有，而ERF132D-Myc（磷酸性反应养成）的花草系LR显现略多。这可是意味着，VIK介导的ERF13磷酸性反应和可分解增强了LR的显现。 
图6 VIK介导的ERF13磷硝化作用促进会LR的造成
07、VIK在侧根發育中磷硝化作用并稳定性LBD18蛋清
顺利通过剖析二个VIK T-DNA加上变化体（vik-2和vik-3），发掘与也是型比起来，变化体的侧根（LR）强度、LR原基（LRP）和已胸部發育期的LR有明显减小，特别的是vik-2（图7）。颠倒，过表述VIK的转DNA水稻遗传植物体成绩出LR强度提升。还有就是，在vik-2变化体大环境下表述VIK的转DNA水稻遗传植物体恢复过来了LR胸部發育期偏差。出现素操作实践反映，vik-2变化体对出现素诱骗的LR胸部發育期不起影响降低，反映VIK在出现素改善LR胸部發育期中激发重中之重影响。 
图7 VIK 在LR出现操作过程中直观磷碱化和可靠LBD18蛋白酶
PART 02 内容个人心得体会
生长素作为最重要的植物激素之一，在调控植物生长和发育过程中起着关键作用。这项研究通过磷硝化作用球氨基酸组学浅析筛选到快速响应生长素的蛋白激酶VIK，并证实VIK通过调控LBD18和ERF13来调控侧根的形成。一方面，生长素以ARF7/19依赖的方式诱导VIK的转录；另一方面，它通过TMK1激活VIK的激酶活性，激活的VIK可以磷酸化LBD18和ERF13。磷酸化的LBD18变得更加稳定，调节侧根的启动。然而，磷酸化的ERF13经历降解，缓解了其对侧根出现的抑制，从而促进侧根的形成（图8）。VIK的发现不仅丰富了我们对生长素信号传递机制的理解，而且为农业生产中通过调控生长素信号来提高作物产量和抗逆性提供了潜在的策略。
图8 VIK介导的生张素数据信息设定侧根养成
PART 03 拜谱工作小结
研究采用磷酸化修饰组学、LC-MS/MS质谱分析、CO-IP、酵母双杂和荧光素酶互补成像等技术，发现 VIK 介导的生长素信号转导分别通过增强 LBD18 的蛋白质稳定性和诱导 ERF13 的降解来调节 LR 发育。拜谱生物作为一家国内领先的多组学服务公司，可提供完善成熟的脂肪酸质组学、遮盖脂肪酸质组学、分泌组学、转录组学等多组学产品技术服务体系。拜谱特色磷酸化修饰产品—极高深入DIA·磷过酸突显组，采用创新生物富集技木+Astral DIA，超高深度赋能低丰度磷酸化蛋白/位点发掘，单针最高可实现节肢动物子样版10w+、常绿植物子样版5w+磷酸化修饰位点检出，可广泛应用于植物、动物研究，绘制物种磷酸化修饰图谱，助力高分文章发表。此外，磷酸化修饰组学可与蛋白组学、代谢组学等多组学联合，整合多组学数据进行深入挖掘分析，全面解析机制机理等。欢迎咨询！
选取文献综述：
Shang E, Wei K, Lv B, Zhang X, Lin X, Ding Z, Leng J, Tian H, Ding Z. VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis. Adv Sci (Weinh). 2024 Jul 3:e2402442. doi: 10.1002/advs.202402442. Epub ahead of print. PMID: 38958531.
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